Однако давление на византийских участников собора со стороны Папы Римского и византийского императора, заинтересованного по политическим мотивам в быстром заключении унии, привело к тому, что сначала, допустив поблажки в вопросах Filioque, греки в быстром времени «сдали» и все другие позиции, по которым раньше старались вести богословскую дискуссию. Евгений ІV, заявив о необходимости ликвидировать какие-либо недоразумения вероучений, требовал от византийцев также признать католическое учение о чистилище, латинскую традицию свершения Литургии на опресноках и западное учение об «преосуществлении» хлеба и вина в Тело и Кровь Христовы при словах Спасителя на Тайной вечере «…Приимите, ядите, сие есть Тело Мое…» и «Пийте от нея вси, сия есть Кровь Моя…».  

От византийских представителей также требовали признать примат Папы Римского не как первенство по чести среди пяти Патриархов, но как юрисдикционное главенство над Единой Церковью. В заключительном соборном документе об унии декларировалось, что Папа Римский есть «преемник блаженного апостола Петра, князя апостолов, истинным викарием Христа, главой всей Церкви, отцом и учителем всех христиан», получив через апостола Петра от Самого Христа всю полноту власти над Вселенской Церковью. Единственное, что византийцам удалось сберечь из «наследия» Православной Церкви, – это ее восточный богослужебный обряд. В соборном декрете об унии было подчеркнуто, что восточная Литургия и западная месса являются равноценными и равночтимыми.

Митрополит Киевский и всея Руси Исидор вместе со своим единомышленником митрополитом Никейским Виссарионом сыграли ключевую роль в том, что византийская делегация капитулировала перед католиками. 4 июля 1439 г. от лица византийской делегации католической стороне было передано заявление о согласии признать учение Западной Церкви истинным и про желание воссоединиться с западными христианами в Единую Церковь. После достижения конечной договоренности был составлен на двух языках, латинском и греческом, текст ороса – главного документа Ферраро-Флорентийского собора. Когда готовился текст ороса, митрополиты Исидор и Виссарион предложили внести в него положение об отлучении от Церкви всех противников «унии». Тем не менее, император и другие члены византийской делегации на это не согласились.

5 июля орос был скреплен подписями участников собора, в том числе – 33 византийскими представителями. Среди них не было митрополита Марка Эфесского: святитель остался верен своей позиции полного непринятия католического учения о схождении Святого Духа от Сына. Сильвестр Сиропул сообщает, что во время церемонии подписания унии греками «…о митрополите Эфесском никто не сказал ни слова…». Также не подписал унию епископ Исайя Ставрупольский, который считался малообразованным в богословских вопросах, который, как оказалось, тайно сбежал из Флоренции. По свидетельству московского летописца, унию также не подписали митрополиты Григорий Иверский, Исаакий Нитрийский и Софроний Газский.

Исидор, который проявил себя как один из самых ревностных сторонников заключения унии, соответственно и подписал ее: «…Исидор, митрополит Киевский и всея Руси и представитель апостольской кафедры Святейшего Патриарха Антиохийского Дорофея, с любовью соглашаясь и соодобряя, подписую». Подписал унию и Суздальский епископ Авраамий: «…смиренный епископ Авраамио Суждальский подписую…». Симеон Суздалец позже уверял, что Авраамий не хотел подписывать унию, но митрополит же Исидор я его всади в темницу, и седе неделю полну, и тому подписавшуся не хотением, но нужею…». Вернувшись на Русь в 1441 г., Авраамий Суздальский отказался от своей подписи под актом Флорентийской унии.

Евгений ІV очень скоро показал истинное положение вещей в актах Ферраро-Флорентийского собора о правах Восточных Патриархов на фоне декларированной абсолютной власти Папы Римского в Церкви. Понтифик требовал от греческой делегации представить на суд главного противника унии – святителя Марка Эфесского. Также Евгений ІV попробовал организовать с его участием и под его контролем выборы нового Патриарха Константинопольского. И хотя эти две инициативы Евгения получили большое сопротивление императора и греческих иерархов, тенденция к дальнейшему росту вмешательства Рима в дела Восточных Церквей была очевидной.

6 июля 1439 года уния была торжественно объявлена в кафедральном соборе Флоренции – храме Санта-Мария-дель-Фьоре. Мессу совершил папа Евгений ІV, которому сослужили 12 кардиналов и 93 епископа. Вся русская делегация во главе с митрополитом Исидором также присутствовала на акте объявления унии: его придворные, иерархи и другие представители византийской делегации совершили, по западному обычаю, коленопреклонение перед Папой и приняли от него благословение. Митрополита Исидора ждало щедрое вознаграждение от Папы Римского – 17 августа он получил звание «легата от ребра апостольского» в Литве, Ливонии, Руси и Польше. Это решение имело целью, что на всех этих территориях Русский митрополит должен реализовывать решения Ферраро-Флорентийского собора. Сразу после этого Исидор и Виссарион Никейский за особые заслуги в деле заключения унии также получили от Папы кардинальское достоинство.

В конце лета 1439 года греческие участники собора стали покидать Флоренцию. 6 сентября отправилась и русская делегация во главе с Исидором. Греческий митрополит ехал на Русь довольно неспешно. До конца марта 1440 года он только въехал в Краков. Скорее всего, Исидор не спешил, ожидая первых «сигналов» по принятию унии. Кроме того, ему важно было утвердить унию в Западной части Русской митрополии. А между тем, Польский и Венгерский король Владислав ІІІ Варненчик и его брат, Великий князь Литовский Казимир Ягеллончик, как и большинство монархов Европы, поддерживали сторону Базельского собора, который признавало и большинство католических иерархов Польши и Литвы. Евгений ІV отлучил от Церкви участников Базельского собора, причем Исидор присутствовал при этом акте. Эти обстоятельства непосредственно негативно обозначились в плане утверждения унии в западнорусских землях, несмотря даже на то, что предварительно польские и литовские правители неоднократно выступали за объединение Православной и Католической Церквей.

Еще 5 марта 1440 года Исидор направил своей пастве окружное послание по проекту унии. В нем митрополит писал, что отныне христиане латинского и греческого обрядов должны вступать в евхаристическое общение друг с другом и иметь равные права в лоне Единой Церкви. Обращаясь к римо-католикам, Исидор указывал на истинность православного крещения. Это было обусловлено тем, что в конце ХІV – первой половине ХV в. в случае перехода православных в католицизм их достаточно часто перекрещивали радикальные польско-литовские католические иерархи. Поэтому позиция Исидора закономерно вызвала недовольство Католической Церкви Польши, которая до Тридентского собора отказывалась признавать законность крещения, совершенного в Православной Церкви, и не принимала решение Ферраро-Флорентийского собора, в соответствии с которым, покорившись Папе и приняв унию, восточные христиане имели возможность сохранять греческий обряд и отдельную иерархию.

Тем не менее, на правах папского легата митрополит-кардинал Исидор совершал на территории Польши богослужения по греческому обряду в латинских костелах. Новгородский летописец также отмечает, что Русский митрополит «повеле в лячкых божницах рускым попом свою службу служити, а в рускых церквах капланом». Очевидно, что таким демонстративным образом митрополит хотел подчеркнуть перед польскими католическими иерархами равноправие двух обрядов в лоне объединенной Флорентийской унией Церкви. Наоборот, Католическая Церковь в Польше требовала полной ассимиляции восточных христиан в латинской традиции. Такая позиция польско-литовских католиков стала одной из причин, по которым они стали на сторону Базельского собора, который имел подобные позиции, а не Евгения ІV и Ферраро-Флорентийского собора, который выступал за равноправие христиан латинского и греческого обрядов в лоне Единой Церкви, возглавляемой Папой Римским.

По этой причине в августе 1440 года латинский епископ Виленский Матфей вступил в конфликт с Исидором, запретив ему исполнять обязанности папского легата в Литве. Тем не менее, в Кракове Исидору все-таки продемонстрировали внешние признаки уважения. Краковский архиепископ Збигнев Олесницкий принял митрополита-униата очень любезно, а его советник Ян Эльгот произнес проповедь в Ягеллонском университете при участии Исидора, в которой приветствовал заключение Флорентийской унии. После этого Исидор посетил епархии Русской митрополии, находящиеся во владениях Польского королевства, – Холмскую и Перемышльскую, для которых поставил новых епископов. В августе 1440 года митрополит-кардинал посетил Вильно и другие города Великого княжества Литовского, осенью пребывал в Смоленске, после чего поехал в южные области Руси, которые находились в составе Литвы. В Киеве 5 февраля 1441 года князь Александр Олелько Киевский «с своими князьми и с паны и со всею полною своею радою» выдал митрополиту грамоту, которая подтверждала права Русской митрополии на все земли и доходы в Киевской земле.

В целом, судя по всему, отношение к Исидору православных князей Великого княжества Литовского было доброжелательным. Независимо от грамоты Александра Киевского, об этом свидетельствуют и действия Мстиславского князя Юрия Лугвеневича. Он, будучи летом-осенью 1440 года князем в Смоленске, выдал людям Исидора, которые были в его сопровождении во время поездки на Ферраро-Флорентийский собор, Симеона Суздальца, который до того времени был в бегах от митрополита, так как был противником унии.